组成型表达hIL2-HSA融合蛋白表达菌株发酵条件及产物纯化工艺的初步研究.doc

摘要:白细胞介素-2(IL-2)是T细胞分泌的一种淋巴因子，在免疫系统中发挥着重要的作用。IL-2具有增强机体免疫功能，对多种感染性疾病和恶性肿瘤具有很好的治疗作用。目前，在临床上使用的人IL-2均为采用大肠杆菌表达系统生产的基因工程产品，由于IL-2分子量较小且在表达时未被糖基化，使得IL-2人体内半衰期仅为6.9 min。在疾病治疗时，需要大剂量给药才能取得很好的疗效，这种治疗方式也带来了如毛细血管渗漏综合症等的严重副作用，这一矛盾限制了其临床应用。为了延长IL-2在体内的半衰期，本实验室前期采用白蛋白融合技术构建IL-2与人血清白蛋白融合蛋白基因，并将其置于毕赤酵母宿主中以组成型GAP启动子表达IL2-HSA融合蛋白。本研究对该菌株的发酵条件进行了摇瓶优化，探究了其生长最佳条件。依据实验结果得出：最优生长培养基为YPD，碳源浓度为2%。培养温度为25℃时，pH6.0，发酵上清中蛋白表达量最高，约为37.7mg/L。根据前期所得的最优条件进行上罐发酵，IL2-HSA融合蛋白得到成功表达，表达量为180mg/L。对发酵液进行离心收集上清、超滤浓缩后，以Blue Sepharose层析和Octyl Sepharose疏水层析初步纯化IL2-HSA融合蛋白。

关键词：毕赤酵母；GAP启动子；白介素-2；人血清白蛋白；融合蛋白；优化

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1白介素-2概况-1

1.1.1白介素-2的发现与命名-1

1.1.2 白介素-2的生物学特性-1

1.1.3 白介素-2的蛋白结构-1

1.1.4白介素-2的国内外研究进展-2

1.1.5 白介素-2的临床应用及应用前景-3

1.2 人血清白蛋白-3

1.3重组白介素-2的研究-4

1.3.1 IL-2融合蛋白的构建-4

1.3.2 IL2-HSA的市场前景-4

1.4 Pichia pastoris表达系统的特点-4

1.5 GAP启动子特征-5

1.6 立题背景及研究内容-5

1.6.1 立题背景及依据-5

1.6.2 实验内容-5

1.6.3 实验目的-6

第2章 实验材料与方法-8

2.1 实验材料-8

2.1.1 菌种-8

2.1.2摇瓶培养基-8

2.1.2.1平板保存及种子活化培养基-8

2.1.2.2摇瓶发酵培养基-8

2.1.3上罐培养基-8

2.1.3.1种子培养基-8

2.1.3.2 5L发酵罐初始培养基-8

2.1.3.3 5L发酵罐补料培养基-8

2.1.3.4 5L罐pH调节剂-8

2.1.4仪器与设备-9

2.1.5试剂-10

2.1.5.1 蛋白质电泳试剂-10

2.1.5.2 白蛋白检测试剂-10

2.1.5.3 其他试剂-10

2.2 实验方法-10

2.2.1 摇瓶发酵条件优化-10

2.2.1.1 菌体活化-10

2.2.1.2 不同碳源摇瓶发酵培养表达实验-10

2.2.1.3不同温度摇瓶发酵培养表达实验-11

2.2.1.4不同pH摇瓶发酵培养表达实验-11

2.2.2 发酵罐发酵-11

2.2.2.1 种子培养-11

2.2.2.2 上罐发酵-11

2.2.3 融合蛋白的分离纯化-11

2.2.3.1 发酵液的处理-11

2.2.3.2 融合蛋白的粗分离-11

2.2.3.3 融合蛋白的精细分离-12

2.2.4 分析方法-12

2.2.4.1菌体浓度的测定-12

2.2.4.2 SDS-PAGE电泳-12

2.2.4.3 hIL2-HSA蛋白浓度的测定-12

第3章 结果与讨论-14

3.1 摇瓶发酵-14

3.1.1不同碳源摇瓶发酵培养表达实验-14

3.1.2不同温度摇瓶发酵培养表达实验-16

3.1.3不同PH摇瓶发酵培养表达实验-17

3.2 上罐发酵-19

3.2.1 生长曲线-19

3.2.3 发酵过程-19

3.3 rhIL2-HAS初步纯化-20

3.3.1 rhIL2-HSA的超滤浓缩-20

3.3.2 rhIL2-HSA的精细分离-21

3.3.4 优化以及纯化后蛋白浓度-22

4.1 结论-23

4.2 不足之处及未来展望-23

参考文献-25

致  谢-27