rHSA-IFNβ融合蛋白的制备纯化及体外活性评价_制药工程.doc

摘要: β干扰素具有抗病毒、抗增殖和免疫调节作用，广泛用于病毒性感染、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病的治疗或实验性治疗。但由于该药物前体在人体内半衰期较短，极大影响了其成药性，给临床应用带来很多的不便。 

为开展rHSA-IFN β长效蛋白药物的研究，本文利用研究室已构建的含有rHSA-IFN β融合基因的巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）工程菌发酵得到了较高产量的融合蛋白，摸索了一条发酵、纯化工艺，并进行了内毒素检测和体外活性评价，为该融合蛋白药物的临床前研究奠定了基础。

首先对融合蛋白rHSA-IFNβ摇瓶培养条件进行了摸索，放大到5升发酵罐上培养，得到融合蛋白的表达量为185.89 mg/L；通过对融合蛋白rHSA-IFNβ的纯化条件的摸索，制定了一套分离纯化工艺，最后得到了纯度约为95%的目的蛋白，回收率为14.27%；内毒素检测应用鲎试剂凝胶限度试验，通过对照，阳性对照为阳性结果，阴性对照合格，证明该融合蛋白内毒素含量达到药物应用的要求；最后应用细胞病变抑制法，进行了体外活性的评价。

关键词：β干扰素；融合蛋白；纯化；活性评价；内毒素检测

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1 立题背景-1

1.1.1 人干扰素-1

1.1.2 β干扰素-1

1.1.3 融合蛋白-2

1.1.4 国内外研究现状-2

1.2 研究背景及研究内容-3

1.3 研究方法及意义-4

第2章 rHSA-IFNβ在毕赤酵母中的表达-5

2.1 实验材料-5

2.1.1 菌种-5

2.1.2 仪器和设备-5

2.1.3 实验试剂-5

2.1.4 摇瓶培养基-6

2.1.5 上罐培养基-6

2.2 实验方法-6

2.2.1 毕赤酵母的摇瓶培养-6

2.2.2 毕赤酵母在5 L发酵罐上的培养-7

2.2.3 分析方法-7

2.3 实验结果与分析-7

2.3.1 毕赤酵母摇瓶发酵的蛋白表达情况-7

2.3.2 毕赤酵母的上罐发酵-8

第3章 融合蛋白rHSA-IFNβ的分离纯化-11

3.1 实验材料-11

3.1.1 仪器和设备-11

3.1.2 层析填料-11

3.1.3 实验试剂-12

3.2 实验方法-12

3.2.1 发酵液的处理-12

3.2.2 发酵上清液的浓缩-12

3.2.3 Blue Sepharose层析-13

3.2.4 Octyl Sepharose层析-13

3.2.5 SP Sepharose层析-13

3.2.6 蛋白质纯度的测定-13

3.2.7 rHSA-IFNβ融合蛋白浓度的测定-13

3.2.8 总蛋白浓度的测定-14

3.3 实验结果与分析-15

3.3.1 Blue Sepharose 层析-15

3.3.2 Octyl Sepharose层析-16

3.3.3 SP Sepharose层析-16

3.3.4总蛋白含量和融合蛋白含量-17

第四章 融合蛋白rHSA-IFNβ内毒素检测-19

4.1实验材料-19

4.1.1 仪器和设备-19

4.1.2 实验试剂-19

4.2 实验方法-19

4.2.1 细菌内毒素工作品处理-19

4.2.2  LAL试剂的处理-19

4.2.3 检查操作-19

4.2.4 结果判断-20

4.3 实验结果与分析-20

第五章 rHSA-IFNβ融合蛋白的活性评价-21

5.1 实验材料-21

5.1.1 细胞株-21

5.1.2 病毒-21

5.1.3实验仪器-21

5.1.4 实验试剂-21

5.1.5 主要试剂的配制-22

5.1.6 实验基本操作-22

5.2 实验过程-24

5.2.1纯化液的收集-24

5.2.2 IFNβ标准品的前处理-24

5.2.3供试品的前处理-24

5.2.4干扰素效价的测定-24

5.3 实验结果与分析-24

5.3.1病毒效价的测定-24

5.3.2 IFNβ标准品活性的测定-25

5.3.3纯化液中融合蛋白效价的测定-25

5.3.4 结果分析-26

第六章 结论与展望-27

6.1结论-27

6.2不足之处及未来展望-27

参考文献-29

致  谢-31