肿瘤耐药细胞株的建立及其耐药相关蛋白表达的检测_制药工程.doc

摘要:目前肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）仍是临床上肿瘤化疗失败的主要原因。尽管多年来对于肿瘤多药耐药机理的研究层出不穷，但多药耐药仍是尚未解决的难题。本研究室对肿瘤多药耐药机制的研究也已有多年的历史，通过药物低剂量持续诱导的方法构建了人乳腺癌细胞的耐阿霉素细胞株，对野生型细胞和耐药型细胞比较后发现了一些新的与耐药相关的差异信息，有望为肿瘤多药耐药机理的研究提供新的依据。然而，前期的研究都集中在将细胞耐药前后进行比较，检测两者差异并进行机理的分析研究，而忽略了肿瘤细胞在逐渐转化成耐药细胞的过程中所发生的变化。本课题立足于通过示踪式的方法为肿瘤多药耐药机理的研究提供更可靠的依据，同时也为开发新型抗肿瘤药物提供理论依据。

本课题通过在药物低剂量持续诱导人乳腺癌细胞（MCF-7）以及黑色素瘤细胞（B16）的过程中，检测细胞形态、对药物的敏感性以及耐药相关蛋白表达谱的变化，有望为先前的研究提供更可靠的依据。研究结果显示：随着药物浓度的增加和诱导时间的延长，细胞对化疗药物的敏感性逐渐减弱，细胞形态趋向细长、松散，耐药相关蛋白瞬时受体电位离子通道亚家族C5蛋白（Transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 5 ，TRPC5）在B16细胞中的表达开始上调，但是可能由于诱导时间较短， P-糖蛋白 (P-glycoprotein，P-gp)的表达并未发生明显变化。该结果提示，在药物诱导初期，细胞的形态以及对药物的敏感性均已开始向耐药型转变，但耐药相关蛋白特别是P-gp的表达变化是长期诱导的结果。

关键词：多药耐药；阿霉素；肿瘤；人乳腺癌细胞；黑色素瘤细胞

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1 立题背景-1

1.2 耐药相关蛋白研究成果-2

1.2.1 P-糖蛋白 (P-glycoprotein，P-gp)-2

1.2.2 P-糖蛋白的功能及其产生耐药的机制-3

1.2.3 P-糖蛋白抑制剂的研究进展-4

1.2.4 瞬间受体电位通道蛋白-5

1.3 研究意义-6

第2章 材料与方法-8

2.1 药品试剂及仪器-8

2.1.1 材料-8

2.1.2 实验试剂-8

2.1.2 实验仪器-8

2.2 实验方法-9

2.2.1 无菌操作基本技术-9

2.2.2 细胞培养液的配制-10

2.2.3 PBS缓冲液的配制-10

2.2.4胰酶的配制-10

2.2.5 细胞复苏-10

2.2.6 细胞传代培养-10

2.2.7 低浓度加量持续诱导法诱导亲本细胞株-10

2.2.8 细胞冻存-10

2.2.9 细胞计数-10

2.2.10 MTT法测定细胞IC50-11

2.2.11 细胞半数抑制率（IC50)的测定-11

2.2.12 细胞总蛋白的提取-11

2.2.13 全细胞蛋白电泳-12

2.2.14 Western blot 检测细胞蛋白的表达-12

2.2.15 增强化学发光法（ECL)-13

第3章 结果与分析-14

3.1 MTT法检测MCF-7细胞生长情况-14

3.2 MTT法检测B16细胞生长情况-15

3.3 倒置显微镜观察MCF-7细胞的形态变化-17

3.4 倒置显微镜观察B16细胞的形态变化-18

3.5 Western blot检测MCF-7细胞耐药相关蛋白变化情况-19

3.6 Western blot检测B16细胞耐药相关蛋白变化情况-20

第4章 结论与展望-22

4.1 结论-22

4.2 不足之处与改进-22

4.3未来展望-23

参考文献-23

致  谢-26