基于定量PCR技术的镇江香醋发酵过程中功能微生物的研究.doc

摘要: 镇江香醋的酿造是一个多菌种混合式的复杂固体发酵过程。本课题利用荧光定量PCR技术对复杂的醋酸发酵过程中功能微生物的动态变化规律进行研究，从而在微生物生物量水平解析醋酸的固态发酵过程，为进一步研究微生物与食醋风味物质形成相关性奠定研究基础。本课题的主要研究结果如下：

对镇江香醋醋酸发酵过程中相对丰度最高的醋酸菌 (Acetobacter pasteurianus)和乳酸菌 (Lactobacillus helveticus)的代谢产物进行功能性鉴定，结果表明Acetobacter pasteurianus和Lactobacillus helveticus具有很强的产乙酸和乳酸的能力，并且产羧酸类、吡嗪类等挥发性物质能力较强，证实了这两株菌是与酿醋有关的主要功能微生物。

在功能微生物筛选的基础上，针对各自的引物特异性建立了荧光定量PCR方法，对镇江香醋醋酸发酵过程中总细菌、总真菌、醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌和两种特异性菌株(Acetobacter pasteurianus和Lactobacillus helveticus)的变化进行了定量分析。研究结果表明，除总真菌以外的其他菌株在发酵过程的消长情况类似：生物量均在第7 d前后达到最大值，随后随发酵的进行而不断降低；而总真菌在发酵第4 d生物量就达到了最大值。在镇江香醋醋酸发酵阶段，总细菌的生物量最大可达到5.37×1014 copies/g 干醅，醋酸菌和乳酸菌生物量的最大值分别达到4.62×1011copies/g 干醅和5.54×1012copies/g 干醅，而芽孢杆菌仅有3.26×1010copies/g 干醅，与乳酸菌相比少了两个数量级。Acetobacter pasteurianus和Lactobacillus helveticus的生物量最大值分别为3.33×1011copies/g 干醅和1.21×1012copies/g 干醅，和醋酸菌、乳酸菌生物量均在同一数量级上，表明Acetobacter pasteurianus和Lactobacillus helveticus在醋酸菌和乳酸菌中所占比例极大，是与酿醋有关的主要功能微生物。

关键词：镇江香醋；功能微生物；荧光定量PCR；拷贝数

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1 简介-1

1.2 食醋的功能性-1

1.2.1 古代人们对食醋功能性的认识-1

1.2.2 现代关于食醋的功能性-1

1.3 镇江恒顺香醋简介及其研究进展-2

1.3.1 镇江香醋简介-2

1.3.2 食醋中功能性物质的研究-2

1.3.3 食醋酿造过程中功能微生物的研究-3

1.4 定量PCR技术研究镇江香醋发酵过程功能微生物变化的可行性-4

1.4.1 定量PCR技术简介-4

1.4.2 定量PCR技术国内外研究进展-4

1.4.3 基于定量PCR技术研究镇江香醋中功能微生物变化的必要-4

1.5 本课题要达到的目的与要求-4

第2章 材料与方法-7

2.1 实验材料-7

2.1.1 仪器设备-7

2.1.2 主要试剂-7

2.1.3 培养基-7

2.2 功能微生物的确定-8

2.2.1 菌种来源-8

2.2.2 功能微生物的功能性分析-8

2.3 荧光定量PCR方法学的建立-10

2.3.1 引物的设计-10

2.3.2 标准品的制备-10

2.3.3 荧光定量标准曲线的建立-13

2.3.4 荧光定量PCR方法特异性、敏感性和重复性的验证-15

2.4 醋醅样品中功能微生物拷贝数的测定-15

2.4.1 采集样品并提取样品总DNA-15

2.4.2 荧光定量PCR方法测定样品拷贝数-15

第3章 结果与讨论-17

3.1 功能微生物的筛选-17

3.1.1 根据丰度选取功能微生物-17

3.1.2 发酵液有机酸组成分析-18

3.1.3 发酵液挥发性成分分析-19

3.1.4 小结-21

3.2 Real-time PCR标准曲线和熔解曲线的绘制-21

3.2.1 总细菌Real-time PCR标准曲线及熔解曲线的绘制-22

3.2.2 总真菌Real-time PCR标准曲线及熔解曲线的绘制-22

3.2.3 醋酸菌Real-time PCR标准曲线及熔解曲线的绘制-23

3.2.4 乳酸菌Real-time PCR标准曲线及熔解曲线的绘制-24

3.2.5 芽孢杆菌Real-time PCR标准曲线及熔解曲线的绘制-25

3.2.6 巴氏醋酸菌Real-time PCR标准曲线及熔解曲线的绘制-25

3.2.7 瑞士乳杆菌Real-time PCR标准曲线及熔解曲线的绘制-26

3.3 镇江香醋醋酸发酵过程中细菌和真菌生物量的分析-27

3.3.1 总细菌生物量的分析-27

3.3.2 总真菌生物量的分析-28

3.3.3 醋酸菌生物量的分析-30

3.3.4 乳酸菌生物量的分析-31

3.3.5 芽孢杆菌生物量的分析-32

3.3.6 巴氏醋酸菌生物量的分析-33

3.3.7 瑞士乳杆菌生物量的分析-35

第4章 结论与展望-37

4.1 结论-37

4.2 展望-37

致  谢-39

参考文献-41