产腈水解酶重组菌的发酵条件优化及酶学性质的研究.doc

摘要: 腈水解酶可以催化腈类化合物生成相应羧酸及氨，它的反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失少，具有区域选择性、立体选择性和化学选择性，具有很大研究潜力。

本实验利用单因素实验，对产腈水解酶的重组大肠杆菌的培养基种类、培养基成分、诱导剂种类和浓度、诱导条件、pH值和温度等培养条件进行了系统的优化。摇瓶发酵优化条件得出：以甘油作为主要碳源，蛋白胨和酵母膏作为主要氮源，并添加微量元素的SOC培养基作为发酵培养基，最适接种量为0.5 %，较优的诱导剂诱导条件为：采用0.5 mM 的IPTG诱导12 h，发酵培养基pH为7.5，诱导温度25 ℃时产酶效果最佳。经过优化后，重组酶的生物量、比酶活及总酶活得到了显著提高，总酶活和比酶活分别达到了0.768 U/mL和0.085 U/mL。5 L发酵的扩大发酵实验表明产酶效果良好，总酶活和比酶活均与摇瓶水平基本持平。

随后，对优化后的产酶细胞进行了全细胞酶学性质考察。实验研究结果表明，该菌株所产腈水解酶催化反应的最适催化反应温度是45 ℃，最适反应pH为7.2左右；对底物谱的考察表明该酶具有广泛的底物谱，能催化多种腈类化合物水解，当采用3-氰基吡啶及4-氰基吡啶为底物时重组酶活性最高；在反应液中添加镁离子、镍离子和5%的甲醇对酶反应有一定的促进作用；温度稳定性的研究显示，30、40及50 ℃时酶的半衰期分别为24.75 h，2.55 h和1.34 h。

关键词：腈水解酶；优化；酶学性质；重组大肠杆菌

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1立题背景和意义-1

1.2国内外研究现状及应用前景-2

1.3烟酸研究进展-4

1.4本课题研究的主要内容-5

第2章 实验材料与方法-7

2.1 实验材料-7

2.1.1 菌株-7

2.1.2 实验仪器-7

2.1.3 实验试剂-7

2.1.4 培养基配制:-8

2.2实验方法-8

2.2.1菌种培养方法-8

2.2.2 酶活测定方法-8

2.2.3 培养条件优化方法-9

2.2.4 发酵罐发酵培养-10

2.2.5 酶学性质的研究方法-10

第3章 实验结果与分析-13

3.1摇瓶发酵优化的结果-13

3.1.1 培养基种类的优化-13

3.1.2 培养基组分优化-13

3.1.3 接种量的优化-14

3.1.4 诱导剂种类的优化-15

3.1.5 诱导剂浓度的优化-15

3.1.6 诱导剂添加时机的优化-16

3.1.7 pH的优化-16

3.1.8 诱导温度的优化-17

3.1.9 诱导时间的优化-17

3.1.10 验证-18

3.2 发酵罐的发酵结果-19

3.3 酶学性质的研究结果-19

3.3.1 最适反应温度-19

3.3.2 最适反应pH-20

3.3.3 金属离子和酶修饰剂的影响-20

3.3.4 底物谱-21

3.3.5 温度稳定性-22

3.3.6 有机溶剂-23

第4章 结论与展望-25

4.1 结论-25

4.2 展望与不足之处-25

参考文献-27

致谢-29