毕赤酵母表达融合蛋白HSA-rhddADAM15-His纯化方法研究_制药工程.doc

摘要:ADAMl5作为ADAM家族中唯一一个在去整合素结构域含有RGD基序的成员，其生物学功能、在肿瘤发展演变中的作用机制和对抗肿瘤药物研制的指导意义已经为研究热点。然而天然来源的ADAMl5非常有限，不能满足深入研究的需要。本实验在成功通过毕赤酵母工程菌发酵表达融合蛋白HSA-rhddADAMl5-His的基础上，使用AKTA蛋白纯化系统，经Cibacron Blue F3GA染料配体亲和层析柱、镍离子金属螯合亲和层析柱、DEAE离子交换层析柱分离纯化后，Western blot 结果证实纯化的最终产物是融合蛋白HSA-rhddADAM15-His。SDS-PAGE蛋白电泳分析获得的融合蛋白HSA-rhddADAMl5-His样品的纯度最高达到60%。

关键词：融合蛋白HSA-rhddADAMl5-His；毕赤酵母；纯化；SDS-PAGE蛋白电泳

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1ADAM家族-1

1. 2ADAM15-1

1.2.1 ADAM15概述-1

1.2.2国内外ADAM15制备研究现状-1

1.3毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化-2

1.3.1毕赤酵母表达系统-2

1.3.2重组蛋白分离纯化的主要方法-3

1.4立题背景-4

1.5本课题研究的主要内容-4

第2章 材料与方法-5

2.1 实验材料-5

2.1.1 菌种-5

2.1.2实验试剂-5

2.1.3实验仪器-5

2.1.3主要试剂配制-6

2.1.4培养基配制-6

2.2 主要实验方法原理-7

2.2.1Blue柱-7

2.2.2镍离子亲和柱-7

2.2.3DEAE与SP离子交换层析柱-8

2.2.4SDS-PAGE电泳-8

2.2.5Western免疫印迹-9

2.3 实验方法-10

2.3.1表达毕赤酵母工程菌的发酵-10

2.3.2SDS-PAGE 电泳鉴定-10

2.3.3融合蛋白HSA-rhddADAM15-His的纯化-11

2.3.3融合蛋白HSA-rhddADAM15-His的Western免疫印迹-12

第3章 结果与分析-13

3.1 融合蛋白HSA-rhddADAM15-His发酵表达-13

3.1.1不同浓度甲醇诱导表达量对比-13

3.1.2发酵罐表达与摇瓶表达对比-13

3.2 融合蛋白HSA-rhddADAM15-His的纯化-13

3.2.1Blue柱纯化结果-14

3.2.2镍柱纯化结果-15

3.2.3SP柱纯化结果-16

3.2.4DEAE柱纯化结果-18

3.2.5纯化结果小结-19

3.3 融合蛋白HSA-rhddADAM15-His的Western免疫印迹-20

第4章 结论与展望-21

4.1 结论-21

4.2 不足之处及未来展望-21

4.2.1不足之处-21

4.2.2未来展望-21

参考文献-23

致  谢-25