毕赤酵母X-33改造菌GM-CSF的表达_制药工程.doc

摘要:毕赤酵母作为一种单细胞真核生物，既具有生长速度快、表达蛋白产量高、培养成本低等优点，又能像真核细胞那样，对表达的蛋白进行翻译后修饰，如糖基化，因此广泛用于各种重组外源蛋白的表达[1]。但是，毕赤酵母高甘露糖型结构与哺乳动物中的复杂型糖链结构显著不同, 而重组糖蛋白的功能和特点[11-12] 会因糖链结构不同而改变。在人体内，毕赤酵母高甘露糖型糖链与甘露糖受体结合，产生免疫反应[13]并导致药物动力学性质不良，如那些具有甘露糖末端结构的糖蛋白的清除率很高[14]，这便限制了毕赤酵母作为表达系统来生产重组糖蛋白。为了降低毕赤酵母对糖蛋白的过度糖基化修饰，构建一个对糖蛋白低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统，本文采用了OCH1基因缺失的X-33（och1-）菌株作为宿主菌，对糖蛋白GM-CSF进行表达，并对蛋白表达情况进行了分析。实验结果发现，野生X-33菌株表达的GM-CSF蛋白分子量在35kDd左右，X-33(och1-)改造菌表达的GM-CSF蛋白分子量主要在25 kDa左右，分子量明显降低；在相同培养条件下，野生菌X-33表达的GM-CSF含量为171.5mg/L,而X-33（och1-）菌株表达的GM-CSF含量约为281mg/L, 说明OCH1基因的缺失，并没有对蛋白表达量造成太大影响。结论：X-33（och1-）菌株表达的GM-CSF分子量明显降低，推测OCH1基因的敲除，X-33(och1-)表达的GM-CSF糖基化修饰程度降低，为低糖基化的蛋白，毕赤酵母对糖蛋白的过度糖基化修饰得到改善。

关键词：N-糖基化；GM-CSF；毕赤酵母X-33(och1-)改造菌；蛋白表达；镍柱亲和层

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-2

1.1巴斯德毕赤酵母表达系统-2

1.2酵母N-糖基化-3

1.3粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）-5

1.4国内外研究现状及问题-5

1.5立项背景和意义-6

1.6主要研究内容-7

第2章 实验方法-8

2.1实验材料-8

2.1.1菌株和质粒-8

2.1.2工具酶-8

2.1.3 主要试剂名称-8

2.1.4主要仪器设备-8

2.1.5 主要试剂配制-8

2.1.6 培养基配置-9

2.2主要实验原理方法介绍-9

2.2.1PCR扩增的基本原理-9

2.2.2镍柱亲和层析原理介绍-9

2.3 试验方法-9

2.3.1 质粒提取-9

2.3.2 质粒双酶切鉴定-10

2.3.3 质粒线性化及线性化后进行纯化回收-10

2.3.4 野生菌接种及分装-11

2.3.5 野生菌培养在OD600下测量菌浓-11

2.3.6 野生菌感受态细胞制备-11

2.3.7 GM-CSF电极转化入X-33野生菌并30℃培养-11

2.3.8 筛选出野生X-33表达菌的高产菌株-11

2.3.9用筛选出的高产菌株大规模培养，获得发酵上清-12

2.3.10 X-33野生菌和X-33（och1-）表达的总蛋白含量测定-12

2.3.11野生 X-33表达菌表达的GM-CSF蛋白的一步镍柱纯化-13

2.3.12 X-33（och1-）表达菌表达的GM-CSF蛋白的一步镍柱纯化-13

第3章 实验结果与分析-14

3.1 质粒提取-14

3.2质粒双酶切鉴定-14

3.3质粒线性化及线性化后进行纯化回收-14

3.4野生X-33表达菌筛选高产菌株的筛选-15

3.5 X-33（och1-）表达菌高产菌株的筛选-16

3.6两种表达菌的大规模发酵上清的蛋白含量的测定-17

3.7两种表达菌发酵上清镍柱亲和层析后的蛋白检测-17

第4章 结论与展望-19

4.1结论-19

4.2不足之处及未来展望-20

参考文献-22

致  谢-26