阿魏酸酯酶基因克隆与重组异源表达及在农作物纤维材料降解中的应用.doc

摘要:阿魏酸酯酶是半纤维素降解酶系的组成部分之一，它可以打断半纤维素之间、半纤维素与木质素之间交联的酯键，一方面促进半纤维素、木质素与纤维素的分离，有利于纤维素的进一步利用；另一方面促进阿魏酸等酚酸类物质的分离。阿魏酸酯酶在生物质转化、动物饲料生产和生物合成中具有广泛的应用价值，但目前已知的生产阿魏酸酯酶的菌株的生产能力不能满足工业应用的要求。本文从土壤中筛选出一株能分泌阿魏酸酯酶的细菌出发，克隆得到阿魏酸酯酶基因，通过基因工程的方法构建重组菌株。

本实验克隆得到的阿魏酸酯酶基因大小为1401bp，编码466个氨基酸。运用分子生物学技术将基因插入基因表达载体PGM-T中，将表达载体导入大肠杆菌DH5α中诱导基因表达，通过重组菌株培养液打孔检测阿魏酸酯酶活性确定阿魏酸酯酶基因表达。

酶理化性质实验确定了该阿魏酸酯酶最适作用温度为40℃，最适作用pH值为10。酶稳定性实验显示该酶为嗜碱酶，pH值为11的条件下仍表现出较高活性。酶的稳定性实验显示，酶的热稳定性较差，酶的发酵生产与使用需注意调控温度。

关键词 基因克隆；异源表达；阿魏酸酯酶；嗜碱酶

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1阿魏酸及阿魏酸酯酶的研究概述-1

1.1.1阿魏酸在植物中的存在-1

1.1.2 阿魏酸酯酶的微生物来源-1

1.1.3阿魏酸酯酶的酶学性质与分类-1

1.1.4阿魏酸酯酶的应用开发-2

1.2阿魏酸酯酶基因的克隆、重组与表达-2

1.2.1阿魏酸酯酶基因的克隆-2

1.2.2阿魏酸酯酶基因重组表达-2

1.3 酶工程菌的构建-3

1.3.1 大肠杆菌表达系统-3

1.3.2 大肠杆菌表达载体的组成-3

1.3.3 阿魏酸酯酶的工程菌构建技术-3

1.4 选题背景及意义-3

2材料与方法-5

2.1 主要材料-5

2.1.1培养基-5

2.1.2主要仪器-5

2.1.3主要试剂-6

2.2实验方法-6

2.2.1土壤中菌种的筛选-6

2.2.2产阿魏酸酯酶细菌的初筛-7

2.2.3基因组的提取-7

2.2.4基因扩增(PCR)-9

2.2.5基因纯化-10

2.2.6目的基因的异源表达-10

2.2.7发酵产生阿魏酸酯酶及其分离纯化-11

2.2.8表达出的阿魏酸酯酶的理化性质研究-12

3结果与讨论-14

3.1菌株筛选与基因组提取-14

3.1.1筛选菌株-14

3.1.2筛选菌株基因组的提取检验-14

3.2阿魏酸酯酶基因的克隆-15

3.2.1阿魏酸酯酶基因克隆检测-15

3.2.2基因序列分析-16

3.3基因重组-20

3.3.1阿魏酸酯酶基因与表达载体pGM-T重组鉴定-20

3.4阿魏酸酯酶基因表达检测-21

3.5表达出的阿魏酸酯酶的理化性质研究-22

3.5.1DNS法测表达出的阿魏酸酯酶对农作物纤维的作用酶活力-22

3.5.2 阿魏酸酯酶最适作用pH以及pH的稳定性-22

3.5.3阿魏酸酯酶最适作用温度-23

3.5.4阿魏酸酯酶的热稳定性-24

结论-24

致谢-25

参考文献-26

附录-27