弹性蛋白酶产生菌的筛选鉴定及发酵条件的优化研究.doc

摘要:从奎河附近的土壤和污水中采集到的近20个样品中，经富集培养分离到70多株能产生弹性蛋白酶的菌株，反复初筛、复筛后,分离到一株产胞外弹性蛋白酶活较高且稳定的细菌, 经16S rDNA序列测定为属枯草芽孢杆菌。同时研究了其产酶最适条件,产酶最适碳源为葡萄糖,最适氮源为干酪素。并对碳源、氮源和无机盐进行了正交实验,研究发现碳源对产酶的影响最大, 其次为氮源。当葡萄糖的用量为1%、干酪素为1%、磷酸氢二钠为1.2% 时, 其具有较高的产酶水平。最适发酵初始pH为9.0，250mL最适摇瓶装液量为20mL。在该发酵培养基中培养,48h时达最高的产酶水平。同时还对离心后的粗酶液进行温度和pH试验, 发现该酶最适作用温度和pH分别为50℃和9.0,该酶在50℃以下保温30min酶活仍较高, 在60℃以上酶活全部丧失。在pH7.0～9.0的范围内比较稳定,而在pH7.0以下时,酶活下降很快。金属离子Cu2+、Zn2+、Al3+能抑制弹性蛋白酶的活性,而Fe3+、Li2+能激活弹性蛋白酶活性,螯合剂EDTA则严重抑制弹性蛋白酶活性。

关键词: 弹性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；筛选；鉴定；产酶条件；酶性质

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 弹性蛋白酶的研究现状-1

1.1.1 弹性蛋白酶的分布和定位-1

1.1.2 弹性蛋白酶的结构特性-1

1.1.3 弹性蛋白酶的催化机理-2

1.1.4 弹性蛋白的应用-3

2 材料与方法-5

2.1 仪器与试剂-5

2.1.1 主要仪器-5

2.1.2 主要试剂-5

2.1.3 弹性蛋白底物的制备-6

2.1.4 菌株-6

2.2 培养基-6

2.2.1 斜面培养基（%）-6

2.2.2 平板培养基（%）-6

2.2.3 增殖培养基（%）-7

2.2.4 初筛弹性蛋白培养基（%）-7

2.2.5 发酵种子培养基（%）-7

2.2.6 发酵培养基（%）-7

2.3 培养方法-7

2.3.1 种子斜面及平板培养-7

2.3.2 复筛发酵培养-7

2.4实验方法-7

2.4.1 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法-7

2.5菌种鉴定方法-7

2.5.1 菌落特征-8

2.5.2 16S rDNA菌种鉴定-8

2.6发酵条件优化方法-8

2.6.1 培养方法-8

2.6.2培养基的优化-9

2.6.3 发酵条件的优化-9

3 结果和讨论-10

3.1 菌株筛选-10

3.2 菌株鉴定-11

3.2.1 16S rDNA序列分析-11

3.3菌株EL30产生弹性蛋白酶的条件-12

3.3.1 不同碳源对产酶的影响-12

3.3.2 不同氮源产酶的影响-13

3.3.3 不同无机盐对产酶的影响-13

3.3.4 碳源、氮源和无机盐的合适浓度对产酶的影响-13

3.3.5 不同温度对产酶的影响-14

3.3.6 不同pH对产酶的影响-15

3.3.7 不同发酵时间对产酶的影响-15

3.3.8 不同接种量对产酶的影响-16

3.4粗酶性质的研究-17

3.4.1 弹性蛋白酶的温度稳定性-17

3.4.2 弹性蛋白酶的热稳定性-17

3.4.3 弹性蛋白酶的pH稳定性-18

结论-19

致谢-20

参考文献-21

附录-23

附录1 EL30号菌16S rDNA测序图谱-23