复合诱变黑曲霉选育菊粉酶生产菌株的研究.doc

摘要：本课题以食品生物工程实验中心酶工程实验室保藏的黑曲霉菌株为出发菌株，经过液体深层发酵生产高效内切型菊粉酶。以牛蒡为唯一碳源，从20株黑曲霉菌株中筛选出菊粉酶酶活最高的菌株，为编号08013的菌株，酶活为2.03U/mL。

用紫外线、氯化锂和甲基磺酸乙酯依次对出发菌株进行诱变，根据诱变剂量的变化，来提高黑曲霉菌株的诱变率，从而进行菊粉酶高酶活黑曲霉菌株的筛选。

实验结果表明：对08013菌株进行紫外线诱变，紫外线最佳诱变剂量是30min，致死率为59.34%，在此条件下诱变出发菌株（08013），根据菌落直径与透明圈大小筛选出20株菌落较大的独立菌落进行纯培养，经酶活测定，编号为08-ZL-010菌株酶活最高，为2.27 U/mL,比出发菌株的酶活提高了10.7%。对08-ZL-010进行氯化锂诱变，氯化锂的最佳诱变剂量是0.90%，致死率为77.38%，选育出编号为08-LL-003的菌株酶活酶活最高，为2.62 U/mL，比08-ZL-010菌株的酶活提高了15.4%。对08-LL-003菌株进行甲基磺酸乙酯诱变，甲基磺酸乙酯(EMS)的最佳诱变剂量是0.60 mol/L，致死率为77%，在此条件下，以08-LL-003菌株为出发菌株进行诱变，选育出编号为08-JL-010菌株酶活最高，即2.83 U/mL。以08013菌株为出发菌株，经过紫外线、氯化锂和甲基磺酸乙酯三种诱变剂量的诱变，最终选育出一株酶活最高的菌株08-JL-013，其酶活是2.83U/mL，比出发菌株08013的酶活（2.03 U/mL）提高了39.4%。

对08-JL-013号菌株进行遗传稳定性实验，经过五代稳定性实验，菌株的酶活指标均在2.78 U/mL 到2.83 U/mL之间，说明该菌株具有较稳定的遗传性状。

关键词 内切型菊粉酶；黑曲霉；紫外线；氯化锂；甲基磺酸乙酯(EMS)；诱变

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 菊粉简介-1

1.2 菊粉酶简介-1

1.2.1菊粉酶概念-1

1.2.2 菊粉酶分类-1

1.2.3 菊粉酶性质-1

1.2.4 菊粉酶来源-1

1.2.5 菊粉酶应用-2

1.3 诱变育种-3

1.3.1 诱变育种方法的简介-3

1.3.2诱变剂的种类-3

1.3.3 诱变育种操作流程-3

1.4 本实验研究的内容与意义-4

1.4.1 研究内容-4

1.4.2 研究的意义-4

2 材料与方法-5

2.1实验材料与试剂-5

2.1.1实验材料-5

2.1.2试剂-5

2.2实验设备与仪器-6

2.3 实验方法-6

2.3.1牛蒡汁的制备-6

2.3.2 培养基与化学试剂的制备-7

2.3.3标准曲线的建立-8

2.3.4 菊粉酶酶活的测定-9

2.3.5 黑曲霉菌种的活化与筛选-9

2.3.6 黑曲霉生产菊粉酶的最佳培养时间的确定-10

2.3.7 黑曲霉单孢子悬液的制备-10

2.3.8 黑曲霉细胞的诱变-10

2.3.9 孢子突变率的计算-10

2.3.10 稳定性实验-11

2.3.11 菌种的保藏-11

3 结果与分析-12

3.1 标准曲线的绘制-12

3.2 酶活的测定-13

3.3 菌种的筛选-13

3.4 菊粉酶最佳生产时间的确定-14

3.5 单孢子悬液浓度的确定-15

3.6 诱变剂最佳条件的确定-16

3.6.1 紫外线最佳诱变剂量的确定-16

3.6.2 氯化锂最佳诱变剂量的确定-18

3.6.3 甲基磺酸乙酯最佳诱变剂量的确定-20

3.7 遗传稳定性实验-22

结论-23

致谢-24

参考文献-25