弹性蛋白酶基因的克隆与功能研究.doc

摘要：弹性蛋白酶(elastase)是一类分解不溶性弹性蛋白的蛋白水解酶，该酶主要存在于动物胰脏中。该酶因其能高度专一水解结缔组织中的胶原和弹性硬蛋白，且不破坏其他成分，达到肉类软化而不失口味的目的，优于目前普遍使用的肉类嫩化剂，在食品加工领域有广泛的应用前景。

本文以研究假单胞菌弹性蛋白酶为基础,旨在从微观水平上了解假单胞菌株的弹性蛋白酶基因。从而为人类大规模生产弹性蛋白酶作出贡献。

根据已知的弹性蛋白酶基因序列设计弹性蛋白酶基因引物,扩增弹性蛋白酶全长基因,并与pGM-T载体连接,获得含有Elastase全长基因的重组质粒，进行蓝白斑实验，筛选出白斑，经重组质粒的酶切鉴定与测序分析等方法得出PCR结果为阳性克隆，了解到该编码基因的片段长度为1494bp,编码了498个氨基酸,分子量约为53.5kDa。并进行弹性蛋白酶基因在异源宿主细胞中的表达，得知克隆出的弹性蛋白酶基因能够表达且表达出的弹性蛋白酶具有活性。

关键词： 弹性蛋白酶；基因克隆；序列分析

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 弹性蛋白酶的研究现状-1

1.1.1 弹性蛋白酶的分布-1

1.1.2 弹性蛋白酶的分类与来源-1

1.1.3 弹性蛋白酶的功能与结构-1

1.1.4 弹性蛋白酶的酶源激活和催化机理-2

1.1.5 弹性蛋白酶的应用-3

1.1.5.1 弹性蛋白酶在医药领域的应用-3

1.1.5.2 弹性蛋白酶在食品、日化工业领域的应用-3

1.2 本实验的研究目的与意义-4

2 材料与方法-5

2.1 仪器与试剂-5

2.1.1 主要试剂-5

2.1.2 主要仪器-5

2.1.3 引物-6

2.2 实验方法-6

2.2.1 菌种的保藏-6

2.2.2 基因组的提取-6

2.2.3 弹性蛋白酶基因的PCR扩增及回收-7

2.2.4 目的弹性蛋白酶基因与pGM-T载体的连接过夜

2.2.5 弹性蛋白酶基因的转化及蓝白斑筛选

2.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.5.2 用X-gal平板对克隆进行初步筛选

2.2.5.3 转化子的鉴定

2.2.5.4 将挑选出来的白斑进行重组质粒的酶切鉴定

2.2.5.5 目标质粒的菌落PCR

2.2.6 保种测序

2.2.7 原核表达载体饿构建

3 结果与分析

3.1 基因组的提取及弹性蛋白酶基因的PCR扩增

3.1.1 基因组的提取

3.1.2 弹性蛋白酶基因的PCR扩增

3.2 PCR产物的正确回收

3.3 扩增片段的滞后质粒检测

3.4 基因片段滞后质粒的酶切鉴定

3.5 滞后质粒的PCR扩增检测

3.6 弹性蛋白酶基因的测序及分析

3.7 弹性蛋白酶基因在异源宿主细胞中的表达

3.8 弹性蛋白酶活性的表现

结论

致谢

参考文献

附录