诱变黑曲霉原生质体选育菊粉酶生产菌株的研究.doc

摘要:本课题以食品与生物工程实验中心酶工程实验室保藏的黑曲霉菌种作为菌源，利用黑曲霉细胞深层发酵生产内切型菊粉酶。以牛蒡汁做为碳源，获得产菊粉酶菌株，通过测定发酵液酶活，从20株黑曲霉菌株筛选得到产菊粉酶活力最高的编号为08013的一株黑曲霉菌株，酶活为3.01U/mL。通过连续跟踪测定发酵液中菊粉酶的酶活，确定了最佳发酵时间为108h（4.5d）。

以原生质体形成率为指标，通过单因素实验对最佳酶配比、酶解时间、酶解温度对原生质体的制备条件进行了研究。实验结果表明：蜗牛酶与纤维素酶的最佳配比为3：7，最佳酶解温度30℃，最佳酶解时间为3h。

在单因素试验的基础上，采用正交试验设计对制备黑曲霉原生质体的条件中酶配比、酶解时间、酶解温度3因子的最优化组合进行了定量研究。实验结果为：蜗牛酶与纤维素酶的最佳配比为3：7，最佳酶解时间为3h，最佳酶解温度为30℃，在该最佳条件下的原生质体的形成率最大，为82.29%。

对原生质体进行诱变研究。在紫外线诱变实验中，首先确定最佳诱变剂量，为紫外照射120s，然后再从紫外照射时间为120s的诱变菌株中筛选出20株菌落直径最大的菌株，进行复筛，通过测定酶活选育出一株酶活最高的菌株，为08-YZL-017号菌株，酶活为4.03 U/mL，比出发菌株08013（3.01 U/mL）的酶活提高了33.89%。

随后再对08-YZL-017菌株的原生质体进行氯化锂诱变研究。氯化锂诱变实验中，首先确定最佳诱变剂量，为氯化锂浓度0.5%，然后再从氯化锂浓度为0.5%的诱变菌株中筛选出20株菌落直径最大的菌株，进行复筛，再通过测定酶活选育出一株酶活最高的菌株，为08-YLL-011号菌株，酶活为5.14U/mL，比出发菌株08-YZL-017（4.03 U/mL）的酶活提高了27.54%，比原始出发菌株08013（3.01 U/mL）的酶活提高了70.76%。

对诱变选育出的08-YLL-011号菌株进行遗传稳定性实验，经过连续五代的接种、发酵培养、测定菌落直径和酶活，结果为：菌落直径在21mm-24mm范围内，酶活在5.08-5．22 U/mL之间，实验结果表明，08-YLL-011号菌株的遗传性状较稳定。

关键词 菊粉酶；原生质体；紫外诱变；氯化锂诱变

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 黑曲霉概述-1

1.2 原生质体-1

1.2.1 原生质体概论-1

1.2.2 原生质体诱变育种-1

1.3 低聚果糖-2

1.3.1 低聚果糖的生产工艺-2

1.3.2 低聚果糖的功能-2

1.3.3 低聚果糖的研究现状-2

1.4 菊粉酶-2

1.4.1 菊粉酶的概念-2

1.4.2 菊粉酶的来源-2

1.4.3 菊粉酶的分类-3

1.4.4 菊粉酶在低聚果糖生产中的应用-3

1.4.5 菊粉酶在研究和应用中主要存在的问题-3

1.5 紫外线诱变概论-3

1.6 氯化锂诱变概论-3

1.7 本课题的主要内容及研究意义-4

2 材料与方法-5

2.1 实验材料与试剂-5

2.1.1 实验材料-5

2.1.2 主要试剂-5

2.2 仪器与设备-6

2.3 实验方法-6

2.3.1 培养基的配制-6

2.3.2 黑曲霉菌种的活化-7

2.3.3 葡萄糖标准曲线的建立-8

2.3.4 菊粉酶酶活的测定-8

2.3.5 酶活最高菌株的筛选-9

2.3.6 黑曲霉最佳生产时间的确定-9

2.3.7 黑曲霉原生质体的制备方法-9

2.3.8 原生质体形成率的计算-9

2.3.9 原生质体制备条件的研究-10

2.3.10 紫外诱变与氯化锂复合诱变黑曲霉原生质体-10

2.3.11 诱变菌株遗传稳定性试验-11

3 结果与分析-12

3.1 葡萄糖溶液标准曲线的制备-12

3.2 黑曲霉高产菊粉酶菌株的筛选-12

3.3 菊粉酶最佳生产时间的确定-13

3.4 原生质体制备条件的研究-14

3.4.1 蜗牛酶与纤维素酶配比对原生质体形成率的影响-14

3.4.2 酶解时间对原生质体形成率的影响-15

3.4.3 酶解温度对原生质体形成率的影响-16

3.4.4 正交实验-17

3.5 紫外线照射与氯化锂复合诱变黑曲霉原生质体-19

3.5.1 紫外线诱变黑曲霉原生质体-19

3.5.2 氯化锂诱变黑曲霉原生质体-20

3.5.3 稳定性实验-22

结论-24

致谢-25

参考文献-26