菊粉酶的生产及分离纯化_生物工程.rar

摘要:本论文以食品生物工程实验中心酶工程实验保存的黑曲霉菌株为出发菌株，对20株黑曲霉菌株进行筛选，通过测定内切型菊粉酶酶活，筛选出酶活最高的菌株为E133131，其酶活为0.66U/mL。

　　　将E133131发酵生产的粗酶液用硫酸铵进行分级盐析，浓度依次为0，20，40，60，80，90%，将沉淀用pH5.0的0.1mol/L醋酸缓冲液溶解，经过检测得到硫酸铵浓度为80%时沉淀中所含酶活力较高，其酶活为0.84U/mL。

　　　再将盐析后脱盐透析得到的酶液经聚乙二醇20000浓缩后，再进行二乙胺基乙基纤维素阴离子交换层析，检测得到活性物质聚集在洗脱液0.1mol/L到0.15mol/L梯度之间，并用紫外分光光度计检测其吸光度，并根据葡萄糖标准曲线算出酶活，其酶活为0.71U/mL。

　　　再收集有活性的酶液经聚乙二醇20000浓缩后用葡聚糖凝胶G75分子筛层析，检测得到其酶活为0.89U/mL。

　　　将层析得到的样品液用聚丙烯酰胺凝胶电泳，测定样品蛋白质的分子量，得到三条条带，其蛋白质的分子量分别为73.3 kDa、52.4 kDa和38.2kDa。

关键词 ：黑曲霉；内切型菊粉酶；盐析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；离子交换层析；分子筛层析

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 菊粉酶的性质及其相关应用-1

1.1.1 菊粉酶的性质-1

1.1.2 菊粉酶的应用-1

1.2 内切型菊粉酶的提取-2

1.2.1 菊粉酶的提取方法-2

1.3 研究内容和意义-3

1.3.1 研究内容-3

1.3.2 研究意义-3

2 材料与方法-4

2.1 实验材料-4

2.2 主要仪器-4

2.3 主要试剂-5

2.4 主要培养基及溶液配制方法-6

2.4.1 培养基配制-6

2.4.2 溶液配制-7

2.5 方法及步骤-7

2.5.1 葡糖糖标准曲线的建立-7

2.5.2 菌种活化及传代接种-8

2.5.3 发酵培养-9

2.5.4 粗酶液的贮存-9

2.5.5 内切型菊粉酶酶活的测定-9

2.5.6 硫酸铵盐析-9

2.5.7 脱盐-9

2.5.8 二乙胺基乙基纤维素离子交换层析-10

2.5.9 葡聚糖凝胶G-75分子筛凝胶过滤层析-11

2.5.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳-12

2.5.11 电泳药品的准备-13

2.5.12 SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白分子量-14

3 结果与讨论-16

3.1 目标菌株的确定-16

  3.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制-16

  3.1.2 内切型菊粉酶酶活的测定-17

  3.1.3 菌种的筛选-17

3.1.4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝 G-250法）-18

3.2 菊粉酶的分离纯化-19

3.2.1 硫酸铵分级盐析条件的确定-19

3.2.2 二乙胺基乙基阴离子交换层析-20

3.2.3 葡聚糖凝胶G-75分子筛凝胶过滤层析-21

3.2.4 电泳测定蛋白质分子量-24

3.2.5 纯化总论-25

结论-26

致谢-27

参考文献-28