单甲氧基聚乙二醇修饰生姜蛋白酶及其酶学性质的研究.doc

摘要:本研究运用丙酮沉淀法提取得到生姜蛋白酶粗粉，采用葡聚糖凝胶G-50进一步分离纯化，结果表明：以姜汁酶活力为基准,粗酶的活力纯化倍数为1.2倍, G-50纯化酶的活力纯化倍数为5.2倍。试验研究了生姜蛋白酶的基本酶学性质，结果表明：以酪蛋白为底物时，生姜蛋白酶的最适pH为6.0，最适温度为50℃。

以三聚氯氰活化的单甲氧基聚乙二醇（mPEG）为修饰剂，在单因素试验结果的基础上，选用L9(34)正交实验方案，研究了mPEG对生姜蛋白酶结合修饰效果的影响以及修饰前后酶的性质变化，结果表明：mPEG结合修饰生姜蛋白酶的最佳条件是pH 7.0，温度40℃，mPEG:酶为12:1，修饰时间为1h，mPEG修饰酶的相对酶活力为天然酶的1.88倍，氨基修饰率为59.12%。

修饰酶的酶学性质比较表明：以酪蛋白为底物时，mPEG修饰酶的最适温度和最适pH均有所提高。紫外吸收光谱研究表明，修饰酶的吸收波长较天然酶发生了移动，说明构型构象均发生了变化。酶反应动力学研究表明，mPEG修饰酶的Km值上升，说明经mPEG修饰后，生姜蛋白酶对底物酪蛋白的亲和力降低。

关键词：生姜蛋白酶 ；单甲氧基聚乙二醇；化学修饰；修饰率；酶学性质

目录

摘要

Abstract

1绪论-3

1.1生姜蛋白酶的研究概况-3

1.2生姜蛋白酶化学修饰的研究进展-3

1.3本课题研究内容及意义-4

2 材料与方法-5

2.1 实验材料与仪器设备-5

2.1.1 实验材料-5

2.1.2 仪器设备-5

2.2 实验方法-6

2.2.1 技术路线-6

2.2.2 生姜蛋白粗酶的提取-6

2.2.3 蛋白质含量的测定—考马斯亮蓝法-6

2.2.4 生姜蛋白酶活力的测定-8

2.2.5 生姜蛋白酶的分离纯化-9

2.2.6 生姜蛋白酶与mPEG的结合修饰-9

2.2.7修饰酶的酶反应动力学测定-11

3 结果与分析-12

3.1 生姜蛋白酶的分离纯化-12

3.1.1 生姜蛋白酶分离纯化过程中酶活性的变化-12

3.1.2 生姜蛋白酶的酶学性质-13

3.2.mPEG修饰生姜蛋白酶的结果-15

3.2.1 mPEG修饰生姜蛋白酶的单因素结果-15

3.2.2mPEG修饰生姜蛋白酶的正交实验结果-18

3.3天然酶与修饰酶部分酶学性质的比较-20

3.3.1最适温度-20

3.3.2最适反应pH-20

3.3.3热稳定性比较-21

3.3.4紫外吸收光谱分析-22

3.3.5天然酶与修饰酶的酶反应动力学的比较-22

结论-24

致谢-25

参考文献-26