Klf4转录因子的克隆与表达_制药工程.doc

摘要: Klf4在细胞的增殖、分化、凋亡、胚胎的发育、肿瘤的命运决定等过程中发挥重要作用。

    本实验设计时在klf4目的基因片段前加入了His标签和TAT标签，His标签用来蛋白的分离纯化，而TAT标签则对定向导入靶细胞起着重要作用。与此同时实验分别设计在大肠杆菌的胞内表达和周质空间表达体系，来探讨鼠klf4在大肠杆菌中活性的差别。

    以klf4为模板，分别设计胞内及周质空间表达的引物，克隆出目的基因klf4。目的基因用Nco I 和 Xho I限制性内切酶进行双酶切，然后分别与用相同限制性内切酶酶切的PET28a及PET20b空载体在T4连接酶作用下连接，再转入大肠杆菌进行筛选，得到阳性重组子，构建胞内表达载体PET28a-klf4与周质空间表达载体PET20b-klf4。

    成功构建的胞内与周质空间表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株，对其表达产物进行鉴定，胞内表达主要以包涵体形式存在。之后上罐高密度发酵并以IPTG诱导表达，并对发酵全蛋白进行SDS-PAGE鉴定及目的蛋白的分离纯化。

关键词：Klf4；大肠杆菌；胞内；周质空间；表达；高密度发酵；纯化

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1立题背景及依据-1

1.1.1诱导性多能干细胞概述-1

1.1.2 Klf4转录因子-1

1.1.3大肠杆菌表达体系-1

1.2 本课题研究的主要内容-2

第2章 Klf4基因的克隆与胞内载体PET28a-Klf4的构建-3

2.1 载体构建说明-3

2.2 实验材料-3

2.2.1菌株和质粒-3

2.2.2培养基-3

2.2.3主要试剂及工具酶-3

2.2.4主要仪器-4

2.3 实验方法-5

2.3.1胞内PET28a-Klf4基因的扩增-5

2.3.2 PCR扩增的Klf4基因片段的胶回收-5

2.3.3 PCR扩增胶回收产物Klf4 Xho I/ Nco I双酶切-6

2.3.4 PCR产物纯化-6

2.3.5目的片段Klf4与胞内表达载体PET28a连接-6

2.3.6大肠感受态的制备及转化-6

2.3.7重组质粒pet28a-klf4的鉴定-7

2.3.8重组质粒测序鉴定-8

2.4实验结果与讨论-8

2.4.1 Klf4基因PCR扩增-8

2.4.2重组质粒PET28a-Klf4的构建-9

2.4.3重组质粒测序结果-10

2.4.4实验讨论-11

第3章 周质空间载体PET20b-Klf4构建-13

3.1 实验材料-13

3.1.1 菌株和质粒-13

3.1.2 培养基-13

3.1.3 主要试剂及工具酶-13

3.1.4主要仪器-13

3.2实验方法-13

3.2.1 周质空间PET20b-Klf4载体的构建-13

3.2.2 转化大肠杆菌感受态-14

3.2.3筛选阳性菌株及重组质粒PET20b-Klf4的鉴定-14

3.3实验结果-15

3.3.1表达载体PET20b-Klf4的构建-15

3.3.2 重组子菌液PCR验证.-16

3.3.3双酶切验证-16

3.3.4 实验讨论-16

第4章 重组载体的表达与高密度发酵-17

4.1 实验材料-17

4.1.1 菌株和质粒-17

4.1.2培养基-17

4.1.3试剂-17

4.1.4 实验仪器-17

4.2实验方法-18

4.2.1重组菌BL21(DE3)/PET28a-Klf4 , PET20b-Klf4的构建-18

4.2.2 目的蛋白初步鉴定-18

4.2.3重组野生菌Rosetta(DE3)/PET28a-Klf4的高密度发酵表达-19

4.2.4发酵液全蛋白SDS-PAGE电泳鉴定-19

4.3实验结果-20

4.3.1诱导前后的菌沉淀SDS-PAGE分析-20

4.3.2高密度发酵表达诱导前后产物SDS-PAGE分析鉴定-21

4.3.3实验讨论-22

第5章 目的蛋白的提取及纯化-23

5.1 实验材料-23

5.1.1高密度发酵液-23

5.1.2主要试剂-23

5.1.3 主要仪器-23

5.2 实验方法-24

5.2.1 蛋白的提取及变性-24

5.2.2 目的蛋白过镍柱纯化-24

5.2.3 目的蛋白疏水柱纯化-25

5.2.4 目的蛋白SP柱纯化-25

5.2.5纯化后蛋白透析复性-25

5.3 实验结果-26

5.3.1 镍柱纯化SDS-PAGE鉴定-26

5.3.1 疏水柱及SP柱纯化-27

5.3.1 梯度盐离子透析-27

5.4 实验讨论-27

第6章 结论与展望-29

6.1结果-29

6.2不足之处与未来展望-30

参考文献-31

致  谢-32