植物活性物质对线粒体功能的影响.doc

摘要:[目的] 采用竹叶黄酮中的主要活性成分中的四种代表性单体化学物质：荭草苷、异荭草苷、绿原酸和阿魏酸，作用于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，来建立体外的细胞模型，通过前期的细胞毒性实验来得出毒性作用剂量。在毒性作用剂量下，检测包括线粒体膜电位和胞内活性氧（reative oxygen species,ROS）变化，从细胞器水平来探讨不同植物活性物质的毒性作用，并更深入的探讨其毒性机理和对线粒体活性的影响。

[方法] 使用MTT测定细胞增殖，按试剂盒方法进行测量。采用JC-1探针线粒体膜电位(Δψm) 检测试剂盒测定线粒体膜电位，。在不同时间分别收集经不同种作用浓度单体处理和未经处理的细胞，处理后上流式细胞仪检测。进行细胞器线粒体跨膜电位的测定。取对数生长期的细胞，以4×105/ml密度接种于6孔板上；细胞培养一定时间后，用各单体不同浓度预处理；收集细胞于离心管中：收集处理后的细胞培养液至离心管中；收集加1ml-2ml PBS清洗的清洗液于离心管中；收集胰酶消化的的细胞也于该管中；800-1000rpm/min离心5至8分钟，去上清；加适量PBS缓冲液重悬细胞，再次离心去上清；用PBS重悬细胞；加荧光探针如CM-H2DCFDA，37℃孵育20-30分钟；弃去探针，用PBS洗涤细胞2次以减少背景，然后加入无血清培养基，用IN Cell Analyzer1000活细胞成像系统拍摄荧光图片，软件分析获取ROS荧光值数据来测定ROS的变化。。

［结果］（1）竹叶黄酮四种代表单体绿原酸、阿魏酸、荭草苷和异荭草苷作用于CHO细胞24h后得到的IC50值分别为2857.36、1685.47、1883.71和2344.35μmol/L；（2）采用IC50值剂量下的四种单体作用于CHO细胞24小时，可以明显的导致线粒体膜电位的下降，与空白组比较，阿魏酸组呈极显著性差异，其余三种单体呈显著性差异；（3）采用IC50值剂量下的四种单体作用于CHO细胞24小时，可以明显的导致胞内ROS生成的增多，与空白组比较，阿魏酸组呈极显著性差异，其余三种单体呈显著性差异；由此说明四种单体化合物在细胞毒性剂量下具有一定的线粒体毒性作用，且阿魏酸的作用最强。

［结论］竹叶黄酮主要活性成分中的四种代表性单体化学物质—荭草苷、异荭草苷、绿原酸和阿魏酸对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）在细胞毒性剂量下对的线粒体有一定的损伤作用，且损伤作用有差别。。

关键词：竹叶黄酮，细胞增殖实验的检测方法（MTT），流式细胞仪

目录

摘要

Abstract

引言-1

1 材料与方法-2

1.1 材料-2

1.1.1 细胞株-2

1.1.2 主要试剂-2

1.1.3 主要仪器-2

1.2 方法-2

1.2.1 试剂的配制-2

1.2.2 细胞培养-3

1.2.2.1 细胞复苏-3

1.2.2.2细胞传代-3

1.2.2.3细胞冻存-3

1.2.3MTT测定细胞增殖-4

1.2.4线粒体跨膜电位的测定-4

1.2.5胞内ROS的检测-5

1.2.6统计方法-5

2 结果-5

2.1四种单体化合物的毒性剂量-5

2.2 四种单体化合物在毒性剂量下对线粒体膜电位的影响-6

2.3四种单体化合物在毒性剂量下对胞内ROS的影响-7

结论-9

致谢-10

参考文献-11